流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和計(jì)數(shù)細(xì)菌之多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表征分析
 
 微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)已應(yīng)用于多種研究領(lǐng)域，如環(huán)境監(jiān)控等。流式細(xì)胞術(shù)為鑒定和計(jì)數(shù)不同基質(zhì)中各種不同種屬細(xì)菌提供了可能。通過合適的染色將背景區(qū)別開，以低上樣次數(shù)并以極快的速度進(jìn)行計(jì)數(shù)。現(xiàn)有測(cè)定法也可快速進(jìn)行檢測(cè)，但準(zhǔn)確度較低（例如比濁法），或通過比較法以很慢的速度進(jìn)行檢測(cè)（CFU―菌落形成單位，通常情況下，通過培養(yǎng)并測(cè)定菌落數(shù)需要花費(fèi)48 個(gè)小時(shí)），并可能需要進(jìn)行連續(xù)稀釋，以覆蓋廣泛的潛在濃度。相比之下，F(xiàn)CM（流式細(xì)胞術(shù)）能夠在1 分鐘以內(nèi)即可得出結(jié)果。
 
 本文介紹了使用CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行表征分析。在此有三點(diǎn)相關(guān)說明：第一，此文實(shí)驗(yàn)考察了多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌；第二，對(duì)八種有代表性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌樣本和陰性對(duì)照樣品進(jìn)行了比較，涵蓋了不同細(xì)菌種屬包括球菌和桿菌，并測(cè)試了CytoFLEX 儀器對(duì)細(xì)菌檢測(cè)和計(jì)數(shù)的能力；第三，顯示了多種（6 種對(duì)數(shù)標(biāo)度）濃度和流速范圍內(nèi)的計(jì)數(shù)線性
 
 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包含多種有經(jīng)濟(jì)意義的細(xì)菌屬：通常因?yàn)槠渚哂兄虏⌒?，可?dǎo)致食品污染（例如，單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌等），或與疾病和感染有關(guān)（例如，葡萄球菌和鏈球菌等）。
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 標(biāo)準(zhǔn)流程
 在進(jìn)行CytoFLEX 分析前需要進(jìn)行樣本前處理，將每種待檢測(cè)的細(xì)菌培養(yǎng)基用PBS 重懸并利用比濁法（光密度法）檢測(cè)細(xì)菌濃度，將濃度調(diào)整至0.5McFarland 單位（麥?zhǔn)蠞岫葐挝唬?，?50 x 106mL-1 的菌濃度，將這個(gè)濃度標(biāo)記為[1x]。取出兩份樣品，使用PBS 進(jìn)一步稀釋10 倍和100 倍，分別為15 或 1.5 x 103 μL-1 的菌濃度。
 
 對(duì)未染色樣本和利用核酸染料SYTO（一種具有核酸著染性的活體染料混合物）進(jìn)行標(biāo)記的樣本進(jìn)行流式檢測(cè)（SYTO BC 試劑盒由Thermo Fischer Scientific 公司提供）。根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說明來(lái)使用染料：1 mL 樣品用1 μL 儲(chǔ)存原液（溶于DMSO）進(jìn)行染色，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種染色方案會(huì)導(dǎo)致明顯的二次著染。通過以1：1000 比例稀釋儲(chǔ)備原液（將1 μL 原始儲(chǔ)備液加入1 mL PBS）得到二級(jí)儲(chǔ)備液，然后以1：100 的稀釋比例作為工作濃度進(jìn)行染色（5 μL/500 μL 小份樣品，或1% 的建議濃度），就能得出很好的染色效果
 
 儀器配置
 本實(shí)驗(yàn)僅需要利用藍(lán)色激光來(lái)進(jìn)行前向和側(cè)向散射光的分析（FSC 和SSC）， 并利用FITC 通道測(cè)定綠色SYTO 熒光，所以本試驗(yàn)可使用任何配置的CytoFLEX 進(jìn)行分析。
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 數(shù)據(jù)獲取設(shè)置
 一般情況下，細(xì)菌比大多數(shù)真核細(xì)胞要小，因此，在利用流式分析細(xì)菌時(shí)我們需要對(duì)CytoFLEX 默認(rèn)的FSC （前向散射）和SSC（側(cè)向散射）信號(hào)增益進(jìn)行設(shè)置。熒光通道增益設(shè)置在正常范圍內(nèi)。
 通過在固定檢測(cè)流速內(nèi)進(jìn)行固定時(shí)間的數(shù)據(jù)獲取，可以得到固定的檢測(cè)體積，并更簡(jiǎn)單明了地減去任何背景計(jì)數(shù)。
 比如，進(jìn)行初步表征分析時(shí)，以10 μL/ 分鐘（低）流速，時(shí)間為30 秒，因此，固定的體積為5 μL/ 樣品。
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 以下一系列流式圖均顯示未設(shè)門密度圖并用兩個(gè)散射光的對(duì)數(shù)表示，并用一個(gè)通用的門對(duì)細(xì)菌進(jìn)行圈門（品紅色）。除了對(duì)照外，本分析圖均顯示了未染色樣品圖。
 第二個(gè)流式圖是將SYTO 陽(yáng)性群進(jìn)行設(shè)門的散射光對(duì)數(shù)圖，但這個(gè)散點(diǎn)圖利用一個(gè)藍(lán)色的門對(duì)細(xì)菌進(jìn)行圈門。根據(jù)SYTO 陽(yáng)性群，將第二個(gè)區(qū)域定義為“活的”（藍(lán)色）。
 最后一個(gè)散點(diǎn)圖是綠色（SYTO）熒光通道FITC 的單一參數(shù)疊加直方圖，可比較未標(biāo)記的和標(biāo)記的細(xì)菌樣品比例差別，并將“SYTO+”區(qū)域用于對(duì)第二個(gè)圖進(jìn)行設(shè)門。
 
 注：
 即使在SYTO 染料濃度較低（低至建議濃度的1%）的情況下進(jìn)行檢測(cè)，如果在檢測(cè)了染色樣品后緊接著檢測(cè)未染色的（陰性對(duì)照）樣品，我們需要對(duì)管路進(jìn)行沖洗，防止污染。我們可以在樣品數(shù)據(jù)獲取過程中使用SYTO 熒光對(duì)時(shí)間的散點(diǎn)圖來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。據(jù)推測(cè)，產(chǎn)生這種情況的原因是染料吸附在進(jìn)樣管內(nèi)，然后在后續(xù)的上樣過程中染料被釋放出來(lái)而造成污染?？砂礃悠飞蠘臃绞竭\(yùn)行一份小體積次氯酸鈉稀釋液（10%），并使用蒸餾水進(jìn)行沖洗，可有效控制這個(gè)問題。
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 時(shí)間進(jìn)程QC 顯示SYTO- 標(biāo)記的陽(yáng)性樣本（上圖），顯示由于染料吸附在管路上和釋放導(dǎo)致的劇烈時(shí)程標(biāo)記的陰性對(duì)照，以及樣品管線清潔后的正確陰性對(duì)照（下圖）。
 
 本應(yīng)用說明中顯示的結(jié)果僅代表在貝克曼庫(kù)爾特 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀上產(chǎn)生的結(jié)果。由于分析儀之間存在性能差異，因此，作者不能保證使用其他的流式細(xì)胞儀可得出相似的結(jié)果。
 
 試劑詳情
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 * CytoFLEX 流式細(xì)胞儀僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。